Intorno a noi ci sono molti eroi sconosciuti, apparentemente ordinari, ma che in realtà contribuiscono silenziosamente in modo significativo. La proteinasi K è uno di questi "eroi silenziosi" nel settore della diagnostica molecolare: rispetto ai "grandi e potenti" del settore, la sua importanza è così marginale che per lungo tempo ne abbiamo sottovalutato l'importanza. Con lo scoppio della pandemia di COVID-19, la domanda di proteinasi K è aumentata vertiginosamente, superando di gran lunga l'offerta sia nazionale che estera, e improvvisamente tutti si sono resi conto di quanto sia fondamentale questa proteina.
A cosa serve la proteinasi K?
La proteinasi K è una serina proteasi con attività enzimatica proteolitica e può mantenere la sua attività in un'ampia gamma di ambienti (pH (4-12,5), tampone ad alta concentrazione salina, alta temperatura di 70 °C, ecc.). Inoltre, l'attività della proteinasi K non è inibita da SDS, urea, EDTA, cloridrato di guanidina, isotiocianato di guanidina, ecc., e una certa quantità di detergente può anche aumentarne l'attività. La proteinasi K trova applicazione in diversi ambiti: trattamento medico (disinfezione da virus e microbi), alimentare (intenerimento della carne), concia delle pelli (ammorbidimento del pelo), vinificazione (chiarificazione dell'alcol), preparazione di amminoacidi (degradazione delle piume), estrazione di acidi nucleici, ibridazione in situ, ecc. L'applicazione più comune è l'estrazione di acidi nucleici.
La proteinasi K è in grado di idrolizzare enzimaticamente tutti i tipi di proteine presenti nel campione, inclusi gli istoni strettamente legati agli acidi nucleici, consentendo così il rilascio di questi ultimi nel campione e il loro passaggio nell'estratto, facilitando le successive fasi di estrazione e purificazione. Nell'analisi degli acidi nucleici virali, la proteinasi K rappresenta un componente fondamentale della soluzione di campionamento virale. La proteinasi K è in grado di scindere e inattivare la proteina del capside virale, garantendo maggiore sicurezza durante il trasporto e l'analisi; inoltre, la proteinasi K degrada anche le RNasi, prevenendo la degradazione dell'RNA virale e facilitando l'analisi degli acidi nucleici.
La fama improvvisa della proteinasi K
Sia nel campo della ricerca scientifica che in quello della diagnostica in vitro, l'estrazione degli acidi nucleici è l'esperimento più elementare, pertanto la proteinasi K ha sempre rivestito un ruolo fondamentale. Tuttavia, in passato, la proteinasi K era molto meno conosciuta di quanto il suo ruolo non fosse in realtà. Ciò era dovuto in gran parte alla stabilità del rapporto tra domanda e offerta di proteinasi K. Pochi avrebbero immaginato che la fornitura di proteinasi K potesse diventare un problema.
Con lo scoppio della pandemia di COVID-19, la domanda di test per l'acido nucleico è aumentata vertiginosamente. Alla fine di giugno 2020, la Cina aveva effettuato quasi 90 milioni di test per il COVID-19, una cifra ancora più allarmante a livello globale. Negli esperimenti di estrazione dell'acido nucleico, la concentrazione di proteinasi K utilizzata è di circa 50-200 μg/mL. Generalmente, sono necessari circa 100 μg di proteinasi K per estrarre un campione di acido nucleico. Nell'uso pratico, per aumentare l'efficienza dell'estrazione dell'acido nucleico, spesso si utilizza una quantità maggiore di proteinasi K. La rilevazione dell'acido nucleico del nuovo coronavirus ha generato un'enorme domanda di proteinasi K. L'equilibrio tra domanda e offerta di proteinasi K si è rapidamente alterato, e la proteinasi K è diventata da un giorno all'altro un materiale essenziale per la prevenzione dell'epidemia.
Difficoltà nella produzione di proteinasi K
Sebbene con lo sviluppo dell'epidemia l'importanza della proteinasi K sia stata riconosciuta, è imbarazzante constatare che, a causa della scarsa attenzione riservata a questa proteina, poche aziende nazionali si siano impegnate nella sua produzione. Quando si è cercato di avviare la produzione di proteinasi K, si è scoperto che si tratta di una proteina estremamente particolare. Espandere la capacità produttiva di proteinasi K in un breve periodo di tempo si è rivelata una sfida enorme.
La produzione su larga scala della proteinasi K presenta le seguenti difficoltà
1. Bassa espressione
La proteinasi K può degradare in modo non specifico la maggior parte delle proteine e causare grave tossicità alla cellula ospite di espressione. Pertanto, il livello di espressione della proteinasi K è generalmente molto basso. Lo screening di sistemi di espressione e ceppi che esprimono elevati livelli di proteinasi K richiede in genere un ciclo più lungo.
2. Residui di pigmenti e acidi nucleici
La fermentazione su larga scala introduce una grande quantità di pigmenti e residui di acidi nucleici dell'ospite. È difficile rimuovere queste impurità con un semplice processo di purificazione, e una purificazione complessa aumenta i costi e riduce il tasso di recupero.
3. Instabilità
La proteinasi K non è sufficientemente stabile, può auto-enzimatizzarsi ed è difficile conservarla stabilmente a 37 °C per lungo tempo senza un agente protettivo.
4. Facile da precipitare
Nella preparazione della polvere liofilizzata di proteinasi K, per garantire un elevato contenuto di solidi di proteinasi K nella polvere liofilizzata, è necessario aggiungere un agente protettivo per la liofilizzazione ad alta concentrazione. Tuttavia, quando la concentrazione di proteinasi K raggiunge i 20 mg/mL e oltre, si verifica facilmente l'aggregazione con formazione di un precipitato, il che rende molto difficile la liofilizzazione della proteinasi K ad alto contenuto di solidi.
5. Grande investimento
La proteinasi K possiede una forte attività proteasica ed è in grado di idrolizzare altre proteasi in laboratorio. Pertanto, la ricerca, lo sviluppo e la produzione della proteinasi K richiedono aree di produzione, attrezzature e personale specializzati.
Soluzione di proteinasi K di XD BIOCHEM
XD BIOCHEM possiede una piattaforma matura per l'espressione e la purificazione di proteine e vanta una vasta esperienza nell'espressione e nella purificazione di proteine ricombinanti e nell'ottimizzazione dei processi produttivi. Grazie alla rapida formazione di un team di ricerca e sviluppo, è stato superato il processo di produzione su larga scala della proteinasi K. La produzione mensile di polvere liofilizzata supera i 30 kg. Il prodotto presenta prestazioni stabili, elevata attività enzimatica specifica e non contiene residui di citocromo ospite e acidi nucleici. Benvenuti a contattare XD BIOCHEM per ottenere un pacchetto di prova (e-mail:sales@xdbiochem.comTel: +86 513 81163739).
Le soluzioni tecniche di XD BIOCHEM includono
Grazie all'integrazione di plasmidi multicopia, vengono selezionati ceppi ad alta espressione con un livello di espressione di 8 g/L, superando così il problema del basso livello di espressione della proteinasi K.
Grazie all'implementazione di un processo di purificazione a più fasi, i residui di citocromo ospite e di acido nucleico della proteinasi K sono stati rimossi con successo fino a raggiungere livelli inferiori al valore standard.
Attraverso uno screening ad alta produttività di formulazioni di tamponi protettivi, è stato selezionato un tampone in grado di conservare stabilmente la proteinasi K a 37 °C.
L'utilizzo di tamponi di screening risolve il problema della facile aggregazione e precipitazione della proteinasi K ad alte concentrazioni, ponendo le basi per la liofilizzazione ad alto contenuto di solidi della proteinasi K.
Campione di proteinasi K XD BIOCHEM
Test di stabilità della proteinasi K XD BIOCHEM: non si verificheranno cambiamenti significativi nell'attività dopo 80 giorni a temperatura ambiente.
Test di stabilità della proteinasi K XD BIOCHEM: non si registreranno variazioni significative dell'attività dopo 80 giorni a temperatura ambiente.
Confronto dell'efficacia di estrazione degli acidi nucleici della proteinasi K di XD BIOCHEM e di prodotti concorrenti. Nel processo di estrazione degli acidi nucleici, sono state utilizzate rispettivamente la proteinasi K di XD BIOCHEM e la proteinasi K di un prodotto concorrente. L'efficienza di estrazione della proteinasi K di XD BIOCHEM è superiore e il valore Ct del gene target è inferiore.
Data di pubblicazione: 31 dicembre 2021