L'IPTG (isopropil-β-D-tiogalattoside) è un analogo del substrato della β-galattosidasi, che è altamente inducibile. Sotto l'induzione dell'IPTG, l'induttore può formare un complesso con la proteina repressore, modificandone la conformazione e impedendone il legame con il gene bersaglio, che viene quindi espresso in modo efficiente. Come si dovrebbe quindi determinare la concentrazione di IPTG durante l'esperimento? Maggiore è la concentrazione, migliore è il risultato?
Innanzitutto, cerchiamo di capire il principio dell'induzione dell'IPTG: l'operone del lattosio (elemento) di E. coli contiene tre geni strutturali, Z, Y e A, che codificano rispettivamente per la β-galattosidasi, la permeasi e l'acetiltransferasi. lacZ idrolizza il lattosio in glucosio e galattosio, o in allo-lattosio; lacY permette al lattosio presente nell'ambiente di attraversare la membrana cellulare ed entrare nella cellula; lacA trasferisce il gruppo acetile dall'acetil-CoA al β-galattoside, eliminandone l'effetto tossico. Inoltre, è presente una sequenza operativa O, una sequenza iniziale P e un gene regolatore I. Il gene I codifica per una proteina repressore che può legarsi alla posizione O della sequenza operativa, in modo da reprimere e disattivare l'operone (meta). È presente anche un sito di legame per la proteina attivante il gene catabolico (CAP) a monte della sequenza di inizio P. La sequenza P, la sequenza O e il sito di legame CAP costituiscono insieme la regione regolatrice dell'operone lac. I geni codificanti i tre enzimi sono regolati dalla stessa regione regolatrice per ottenere un'espressione coordinata dei prodotti genici.
In assenza di lattosio, l'operone lac (meta) si trova in uno stato di repressione. In questa fase, il repressore lac espresso dalla sequenza I sotto il controllo della sequenza promotrice PI si lega alla sequenza O, impedendo alla RNA polimerasi di legarsi alla sequenza P e inibendo l'inizio della trascrizione; quando il lattosio è presente, l'operone lac (meta) può essere indotto. In questo sistema operonico (meta), il vero induttore non è il lattosio stesso. Il lattosio entra nella cellula e viene convertito in allolattosio tramite un catalizzatore della β-galattosidasi. Quest'ultimo, come molecola induttrice, si lega alla proteina repressore e ne modifica la conformazione, portando alla dissociazione della proteina repressore dalla sequenza O e all'avvio della trascrizione. L'isopropiltiogalattoside (IPTG) ha lo stesso effetto dell'allolattosio. Si tratta di un induttore molto potente, che non viene metabolizzato dai batteri ed è molto stabile, pertanto è ampiamente utilizzato nei laboratori.
Come determinare la concentrazione ottimale di IPTG? Prendiamo come esempio l'Escherichia coli.
Il ceppo di E. coli BL21 geneticamente modificato contenente il pGEX ricombinante positivo (CGRP/msCT) è stato inoculato in terreno liquido LB contenente 50 μg·mL-1 di Amp e coltivato per una notte a 37 °C. La coltura di cui sopra è stata inoculata in 10 flaconi da 50 mL di terreno liquido LB fresco contenente 50 μg·mL-1 di Amp in un rapporto di 1:100 per la coltura di espansione e, quando il valore OD600 era 0,6~0,8, è stato aggiunto IPTG alla concentrazione finale. è 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1. Dopo l'induzione alla stessa temperatura e allo stesso tempo, è stato prelevato 1 mL della soluzione batterica, le cellule batteriche sono state raccolte mediante centrifugazione e sottoposte a SDS-PAGE per analizzare l'influenza di diverse concentrazioni di IPTG sull'espressione proteica, e quindi selezionare la concentrazione di IPTG con la maggiore espressione proteica.
Dopo gli esperimenti, si è scoperto che la concentrazione di IPTG non è la più elevata possibile. Questo perché l'IPTG ha una certa tossicità per i batteri. Superare la concentrazione limite uccide anche le cellule; e in generale, si spera che maggiore sia la quantità di proteine solubili espresse nella cellula, meglio è, ma in molti casi quando la concentrazione di IPTG è troppo alta, si formerà una grande quantità di inclusioni. Di conseguenza, la concentrazione di IPTG più adatta non è tanto maggiore quanto minore.
Lo scopo dell'induzione e della coltivazione di ceppi geneticamente modificati è quello di aumentare la resa della proteina target e ridurre i costi. L'espressione del gene target non è influenzata solo da fattori propri del ceppo e dal plasmide di espressione, ma anche da altre condizioni esterne, come la concentrazione dell'induttore, la temperatura di induzione e il tempo di induzione. Pertanto, in generale, prima di esprimere e purificare una proteina sconosciuta, è opportuno studiare il tempo di induzione, la temperatura e la concentrazione di IPTG al fine di selezionare le condizioni appropriate e ottenere i migliori risultati sperimentali.
Data di pubblicazione: 31 dicembre 2021