Il ditiotreitolo (DTT) è un agente riducente comunemente utilizzato, noto anche come il nuovo additivo verde.È un piccolo composto organico molecolare con due gruppi mercaptani (-SH).Grazie alle sue proprietà riducenti e alla stabilità, il DTT è ampiamente utilizzato negli esperimenti di biochimica e biologia molecolare.
Il ruolo principale del DTT è ridurre i legami disolfuro nelle proteine e in altre biomolecole.Il legame disolfuro è una parte importante del ripiegamento e della stabilità delle proteine, ma in determinate condizioni sperimentali, come l'analisi SDS-PAGE riducibile, la ricombinazione e il ripiegamento delle proteine, è necessario ridurre il legame disolfuro a due gruppi tiolici per svelare la struttura spaziale delle proteine. la proteina.Il DTT può reagire con i legami disolfuro per ridurli a gruppi mercaptanici, aprendo così la struttura spaziale della proteina e rendendola facile da analizzare e manipolare.
Il DTT può essere utilizzato anche per proteggere l'attività e la stabilità dell'enzima.In alcune reazioni catalizzate da enzimi, l'attività dell'enzima può essere ridotta dall'ossidante.Il DTT può reagire con gli ossidanti per ridurli a sostanze innocue, proteggendo così l'attività e la stabilità dell'enzima.
Rispetto agli agenti riducenti tradizionali come il β-mercaptoetanolo (β-ME), il DTT è considerato un agente riducente più sicuro e più stabile.Non solo è stabile in soluzione acquosa, ma mantiene le sue proprietà riducenti anche ad alte temperature e in condizioni acido-base.
L'uso del DTT è relativamente semplice.In generale, il DTT viene sciolto in un apposito buffer e poi aggiunto al sistema sperimentale.La concentrazione ottimale di DTT deve essere determinata in base all'esperimento specifico e viene generalmente utilizzata nell'intervallo 0,1-1 mM.Concentrazioni più basse possono ridurre gli effetti avversi sulla crescita cellulare e possono ridurre la citotossicità dovuta alla sovraespressione delle proteine bersaglio.Concentrazioni più elevate possono causare un carico metabolico cellulare eccessivo, influenzando la crescita cellulare e l’efficienza di espressione.
Il modo per determinare la concentrazione ottimale può essere quello di valutare il livello di espressione della proteina bersaglio eseguendo test di induzione IPTG a diverse concentrazioni.È possibile eseguire test di coltura su piccola scala utilizzando una gamma di concentrazioni di IPTG (ad esempio 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, ecc.) e l'effetto di espressione a diverse concentrazioni può essere valutato rilevando il livello di espressione della proteina bersaglio (ad esempio Western blot o rilevamento della fluorescenza).In base ai risultati sperimentali, la concentrazione con il miglior effetto di espressione è stata scelta come concentrazione ottimale.
Inoltre, è possibile fare riferimento alla letteratura pertinente o all'esperienza di altri laboratori per comprendere l'intervallo di concentrazione di IPTG comunemente utilizzato in condizioni sperimentali simili e quindi ottimizzare e adattare in base alle esigenze sperimentali.
È importante notare che la concentrazione ottimale può variare a seconda dei diversi sistemi di espressione, delle proteine bersaglio e delle condizioni sperimentali, quindi è meglio ottimizzare caso per caso.
In sintesi, il DTT è un agente riducente comunemente utilizzato che può essere utilizzato per ridurre i legami disolfuro nelle proteine e in altre biomolecole e per proteggere l'attività e la stabilità degli enzimi.È stato ampiamente utilizzato negli esperimenti di biochimica e biologia molecolare.
Orario di pubblicazione: 28 settembre 2023